ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Laporan Praktikum ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay)

Aditya Satriya Nugraha

Mahasiswa Program Magister Ilmu Biomedik

Fakultas Kedokteran Universitas Brawijaya

1.                  Pendahuluan

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) adalah suatu teknik biokimia yang terutama digunakan dalam bidang imunologi untuk mendeteksi kehadiran antibodi atau antigen dalam suatu sampel. Dalam pengertian sederhana, sejumlah antigen yang tidak dikenal ditempelkan pada suatu permukaan, kemudian antibodi spesifik dicucikan pada permukaan tersebut, sehingga akan berikatan dengan antigennya. Antibodi ini terikat dengan suatu enzim, dan pada tahap terakhir, ditambahkan substansi yang dapat diubah oleh enzim menjadi sinyal yang dapat dideteksi. Dalam ELISA fluoresensi, saat cahaya dengan panjang gelombang  tertentu disinarkan pada suatu sampel, kompleks antigen/antibodi akan berfluoresensi sehingga jumlah antigen pada sampel dapat disimpulkan berdasarkan besarnya fluoresensi denan menggunakan spectrofotometer.

Spectrofotometer adalah sebuah alat yang dapat mengukur jumlah dari cahaya yang menembus sumuran dari microplate. Kompleks antigen-antibodi yang kita buat pada well mcroplate akan memberikan perubahan warna pada cairan tersebut, sehingga akan memberikan optical density yang berbeda. Optical density dapat dinyatakan meningkat atau menurun berdasarkan pengenceran material standart, sehingga akan menghasilkan kurva dose-response yang nantinya akan digunakan untuk mengestimasi kadar protein tersebut.

Dalam penggunaan sehari-hari ELISA bisa digunakan unruk melabel suatu antigen atau mengetahui antibody yang ada dalam tubuh. Apabila kita ingin mengetahui antigen apa yang ada di dalam tubuh, maka yang diendapkan adalah antibody-nya, begitu pula sebaliknya.

           

2.                  Tujuan

a.       Menerapkan metode ELISA dengan benar

b.      Mengetahui hasil ikatan antigen-antibodi spesifik

3.                  Metode

Bahan utama yang dipakai adalah Antibody anti-uPar, BSA, PBS, Coating Buffer, PBS-Tween, Alumunium foil, Anti-Rabbit igG, TMB, H₂SO_4.

Langkah –langkah ELISA :

1)        Siapkan plate ELISA dan Plate Layout

2)        Coating antigen

a.     Serum: coating buffer = 1: 1 @ 100µl

b.    BUngkus dengan alumunium foil

c.     Inkubasi dalam suhu 4⁰ selmalam

d.    Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

3)        Coating Blocking buffer (supaya menutupi antigen yang tidak kita inginkan)

a.     1% BSA-PBS @ 100 µl

b.    Bungkus dengan alumunium foil

c.     Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d.    Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

4)        Coating antibody primer (mengikat antigen spesifik yang sudah kita coating sebelumnya)

a.     (Leptin-Rabbun PAb : Blocking Buffer = 1: 500 @ 100 µl

b.    Bungkus dengan alumunium foil

c.     Inkubasikan selama 2 jam pada suhu ruangan

d.    Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

5)        Coating antibody sekunder (untuk mengikat antibody spesifik yang supah kita coating  sebelumnya, dan memberikan tempat untuk molekul pewarnanya)

a.     Anti rabbit IgG Biotin conjugate : PBS = 1: 1000 @ 100 µl

b.    Bungkus dengan alumunium foil

c.     Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d.    Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

6)                  Coating enzim

a.         SAHRP : PBS = 1:1000 @ 100 µl

b.         Bungkus dengan alumunium foil

c.         Inkubasikan selama 1 jam pada suhu ruangan

d.        Buang dan cuci dengan PBS-Tween 3x @ 3 menit @ 100 µl

7)                  Substrat dan Stop solution

a.         Teteskan substrat Tetramethyl benzydine (TMB) @ 50 µl

b.        Inkubasi selama 30 menit dalam suhu ruangan

c.         Tambahkan H₂SO₄ 2N @ 50 µl

d.        Inkubasikan selama 10 menit pada suhu ruangan

8)                  Baca dengan ELISA reader

4.                  Hasil

 Standart IL-6

Standard	Conc. (ng/ml)	OD
1	1000	0.773
2	100	0.298
3	10	0.076
4	1	0.181
5	0.1	0.169
6	0.01	0.248
7	0.001	0.679

Pada hasil ELISA ini didapatkan nilai R² pada kurva 0,4823, yang artinya tingkat akurasinya masih rendah, karena untuk mendapatkan akurasi yang baik dibutuhkan nilai R² mendekati 1. Karena tingkat akurasinya yang masih rendah, maka standart ini tidak bisa dipakai dalam pengukuran selanjutnya.

 Standart uPAR

Standard	Conc. (ng/ml)	OD		Avg OD	log conc.	log O.D
1	0	0.076		0
2	62.5	0.095	0.112	0.0275	1.795880017	-1.56067
3	125	0.129	0.139	0.058	2.096910013	-1.23657
4	250	0.186	0.194	0.114	2.397940009	-0.9431
5	500	0.285	0.302	0.2175	2.698970004	-0.66254
6	1000	0.48	0.497	0.4125	3	-0.38458
7	2000	0.864	0.971	0.8415	3.301029996	-0.07495
8	4000	1.841	1.869	1.779	3.602059991	0.250176

Dari standart uPAR tersebut, diketahui R²-nya 0,9994 yaitu mendekati 1, oleh karena itu kurva ini merupakan kurva yang dapat diterima untuk menghitung kadar sampel dalam pembelajaran ini.

 Korelasi sampel

Nama Sampel	Absorbansi	Log Absorbansi	Log Konsentrasi	Konsentrasi (dalam pengenceran)	Real Konsentrasi
3	0.07	-1.15490196	2.196853996	157.3453801	3933.634503
12	0.166	-0.779891912	2.57718873	377.7363072	9443.40768
16	0.058	-1.236572006	2.114024334	130.0242431	3250.606077
9	0.888	-0.051587034	3.315834651	2069.353333	51733.83333
14	0.121	-0.91721463	2.437916197	274.10452	6852.612999
6	0.044	-1.356547324	1.992345514	98.25293076	2456.323269
5	0.044	-1.356547324	1.992345514	98.25293076	2456.323269
4	0.052	-1.283996656	2.065926312	116.3928526	2909.821314

Dari perhitungan menggunakan kurva uPAR diatas, didapatkan konsentrasi IL-6 (dalam nano liter) pada masing masing sampel.

5.                  Pembahasan

ELISA adalah suatu metode yang dikerjakan sebagai sarana mengukur kadar antigen atau antibodi dalam suatu medium cair, seperti serum atau organ yang telah dicairkan/dilarutkan. Metode ELISA yang dilakukan dalam praktikum ini merupakan metode untuk mengukur kadar IL-6 dalam serum pasien. Prinsipnya adalah adanya ikatan antigen-antibodi yang akan dibaca dengan reaksi enzimatis yang dapat mengakibatkan terjadinya perubahan intensitas warna pada larutan. Intensitas warna ini kemudian akan diukur pada ELISA reader.

Metode ELISA dengan cara diatas adalah model ELISA indirek atau tidak langsung. Metode ini menggunakan ikatan antara antibodi primer dengan antibodi sekunder yang telah dikonjugasikan dengan biotin dan biotin ini akan diikat oleh enzim SAHRP yang akan bereaksi dengan substrat TMB. Penggunaan model ELISA ini bertujuan supaya terjadi amplifikasi reaksi enzimatis yang sehingga intensitas warna yang terjadi akan lebih kuat dan pembacaannya juga lebih mudah.

Secara umum, proses pelaksanaan langkah-langkah ELISA sudah diterapkan dengan benar dibawah bimbingan laboran dar Lab.Biomedik, dan semua peserta mengikuti dengan antusias prosesnya mulai dari awal, namun karena memang keterbatasan alat, tidak semua mahasiswa mencoba dari awal sampai akhir, dan dilakukan prosesnya secara bergantian pada tiap-tiap proses.

Karena prosesnya yang berganti-gantian, didapatkan ketidak akuratan pada hasil standart IL-6,Kemungkinan penyebab dari ketidak akuratan standart bisa karena kekuatan pipetting dan akurasi tiap mahasiswa yang tidak sama.Ada yang benar saat pippeting, dan mungkin saja ada yang kurang benar saat melaksanakannya Oleh karena itu metode ELISA seharusnya dilakukan oleh 1 orang saja sehingga keakuratan dan kekuatan dalam melaksanakan langkah-langkah ELISA akan konsisten.

Karena standart IL-6 yang kurang akurat, maka untuk melanjutkan pelatihan digunakan standart sampel lain yaitu (uPAR) untuk menghitung kadar IL-6 dari sampel. Seharusnya standart yang digunakan adalah standart yang di-running bersama dengan sampel pada saat yang sama. Walaupun  zat yang diukur sama, kita tidak boleh menggunakan standart suatu zat dari ELISA sebelumnya untuk digunakan pada ELISA yang sedang di-running, apalagi menggunakan standart zat yang berbeda. Kembal lagi pada tujuan pembelajaran praktikum ini, maka hal tersebut kami lakukan agar proses pembelajaran berjalan sesuai, dan yang terpenting mahasiswa mengetahui mana yang benar, dan mana yang salah, serta memahami solusi pemecahan masalahnya.

Untuk menghitung kadar dari IL-6 digunakan cara regresi linier, sama dengan cara yang digunakan untuk elektroforesis, namun persamaan garis yang dipakai pada standart adalah persamaan logaritma. Pertama, absorbansi IL-6 hasil spectrophotometri dibuat pada tabel pada Ms. Exel. Kemudian dibuat logaritma dari data absorbansi tersebut dan dibuat logaritma dari standart,lalu dibuatlah persamaan garis terhadap Log absorbansi dan Log konsentrasi dengan sumbu X sebagai Log konsentrasi dan sumbu Y sebagai Log absorbansi. Absorbansi dari sampel selanjutnya juga dibuat logaritmanya. Dengan persamaan garis tersebut, dapat dihitung dan diketahui logaritma konsentrasi dari IL-6. Berikutnya dibuat anti-logaritma dari Log konsentrasi IL-6 yang sudah didapatkan, sehingga akan diketahui konsentrasi IL-6. Namun konsentrasi IL-6 ini adalah konsentrasi dalam pengenceran 25 kali, sehingga untuk mengetahui konsentrasi IL-6 sesungguhnya dalam sampel, konsentrasi yang telah kita dapat ini dikali 25.

6.                  Kesimpulan

a. Mahasiswa melakukan prosedur ELISA dengan baik dan menghitung kadar IL-6 dengan memakai regresi linier

b. Diketahui kadar IL-6 dengan standart uPAR pada sampel 3 adalah 157,35 ng/ml, sampel 12 adalah 377,74 ng/ml, sampel 16 adalah 130,02 ng/ml, sampel 9 adalah 2069,35 ng/ml, sampel 14 adalah 274,1, sampel 6 adalah 98,25, sampel 5 adalah 98,25, dan sampel 4 adalah 116,39

c. Pada praktikum selanjutnya diharapkan mahasiswa dapat melakukan prosedur dengan lebih akurat lagi dan menghasilkan standart yang benar sehingga hasil analisanya akan lebih baik lagi.