Post Translasi Protein Polyglutamine

1.      Pendahuluan

Protein polyglutamine adalah produk dari kesalahan genetik dimana terjadi ekspansi (lebih dari 40 kali) pengulangan gugus CAG pada DNA, dan penyakit yang disebabkan karena kesalahan genetic ini disebut polyQ disease / polyglutamine disease. Tubuh sebenarnya memiliki pertahanan supaya polyglutamine tidak berlebihan dalam proses post translasinya, namun pada perjalanannya,gen-gen yang menyandi proses pertahanan ini mengalami mutasi sehingga timbul manifestasi polyQ disease yang bersifat neurotoksik.PolyQ memperbanyak jumlahnya dengan melalui proses oligomerisasi. Penyakit polyQ sendiri, manifestasinya adalah kelainan saraf degenerative yang berbahaya bagi manusia, beberapa polyQ disease yang telah diidentifikasi antaralain Huntington’s disease, spinocerebellar ataxia (SCA) type 1,2, 3, 6, 7, and 17, dentatorubral pallidoluysian atrophy, dan spinobulbar muscular atrophy ( SBMA) (1).

PolyQ disease adalah penyakit genetic yang diturunkan secara autosomal dominan, kecuali pada penyakit SBMA. Disebutkan diatas bahwa sekuens pengulangan CAG diatas 40, namun ada beberapa penelitian yang mengungkapkan jumlah antara 35-40, dan panjang pengulangan yang terjadi berhubungan dengan usia onset penyakit dan derajat keparanhannya. Melihat fakta-fakta tersebut dapat disimpulkan bahwa kejadian pengulangan CAG/ polyQ adalah kondisi pathogen, dan tidak berhubungan dengan protein yang normal (2).

Agregasi dari PolyQ protein adalah inti dari kesalahan modifikasi posttranslasi yang akan berpengaruh pada jalur-jalur selanjutnya seperti gangguan pada protein folding dan transkripsi gen, serta pemecahan oleh protesase didalam sel kemudian terjadi pembentukan oligomere dan amyloid fibril aggregate sehingga mereka menumpuk sebagai inclusion boddies didalam neuron yang bersifat neurodegenerative. Protein-protein lain yang berperan didaam agregasi inclusion boddies antaralain transcription factors, molecular chaperones ,cytoskeletal proteins dan  proteasomal subunits (3,4)

Gambar 1. Patogenesis neurodegenerasi karena PolyQ protein

Berikut ini adalah beberapa penyakit yang telah diidentifikasi dan ditelaah secara genetic dimana letak kesalahannya sehubungan dengan posttranslasi dari polyQ, dan semuanya memiliki manifestasi gangguan saraf, terutama di susunan saraf sentral

Tabel 1.CAG trinucleotide repeat disorder/ polyQ disorder

Gambar 2. Postranslational modification dari polyQ

2.      Postranslational modification:

Postranslational modification (PTM) yang dilakukan oleh protein polyQ antaralain phosphorylation, acetylation, ubiquitylation, SUMOylation, palmitoylation, transglutamination and proteolytic cleavage.

2.1  Phosphorylation

Fosforilasi adalah penambahan gugus fosfat dan merupakan hal penting dalam terjadinya proses signaling. Fosforilasi menyebabkan perubahan konformasi dan membuat protein menjadi lebih hidrofilik. Fosforilasi penting untuk interaksi protein dengan protein lainnya, dan juga dalam degradasi protein.

Salah satu jalur fosforilasi yang terjadi pada protein polyQ diinisiasi oleh beberapa neutrophin dan sinyal dari growth factor. Dari beberapa growth factor yang berperan, insulin-like growth factor 1(IGF-1) adalah substansi yang paling berpengaruh didalam proses neuroprotektif, sehingga polyQ tidak akan bersifat neurotoxic. Ikatan neurotrophic factor dengan IGF-1 dengan reseptornya, akan mengaktifkan dua jalur signaling yaitu, mitogen-activated protein kinase (MAPK) dan phosphatidyl-inositol 3-kinase/Akt pathways. Kegagalan signaling dari salah satu neurotrophic atau  growth factor, berhubungan dengan insiden terjadinya spinal and bulbar muscular atrophy (SBMA) and Huntington’s disease (HD) (5).Walaupun bukan sebagai penyebab langsung manifestasi penyakit tersebut, namun kegagalan signaling ini memiliki peran penting dalam progresifitas penyakit.

            PolyQ huntingtin (htt), androgen receptor (AR) and ataxin 1 adalah substrat yang penting dalam jalur Akt. Fosforilasi polyQ htt terjadi pada serine 421 akan menurunkan formasi inclusion boddies dan mengurangi neurotoksisitas pada penderita Huntington Disease. Pada Huntington disease sudah ditemukan enam tempat lainnya untuk fosforilasi, yaitu serine 536, 1181 , 1201, 2076, 2653 and 2657 . Dari beberapa jenis tempat ini, serine 1181 dan 1201adalah tempat fosforilasi oleh CDK5. CDK5 juga diketahui melakukan fosforilasi didaerah serine 434. Fosforilasi di kedua tempat ini diketahui menurunkan toksisitas dari protein polyQ. (6,7).

            Fosforilasi PolyQ (androgen receptor)AR  yang terjadi pada serines 215 dan 792, akan menyebabkan berkurangnya ikatan ligand an menurunkan toksisitas pada penyakit SMBA. Beberapa penelitian telah membuktikan beberapa lokasi fosforilasi dari polyQ AR, diantaranya serines 16, 83, 96, 258, 310,426, 516 dan 651 (8).

Fosforilasi dari polyQ AR oleh MAPK pada serine 516 berhubungan dengan peningkatan toksisitas pada penyakit SMBA, namun fosforilasi pada serines 426 dan 516, akan mengakibatkan fenomena yang berlawanan, yaitu penurunan toksisitas. Fosforilasi yang terjadi pada polyQ AR didapatkan juga pada tyrosine 269 dan 365, menghasilkan peningkatan transaktivasi AR dan proliferasi androgen–independent kanker prostat, namun tidak diketahui hubungannya terhadap sel-sel saraf, apakah bersifat toksik atau tidak .Jika fosforilasi pada htt dan AR menimbulkan efek neuroprotektif, fosforilasi dari ataxin 1 pada serine 776 akan meningkatkan stabilisasi polyQ dan pembentukan inclusion boddies (9).

2.2  Acetylation

Asetilasi adalah proses penambahan gugus asetil pada protein, terutama

pada gugus lysine secara reversibel dengan bantuan enzim histone acetyltransferase (HAT),contohnya yaitu CREB-binding protein (CBP), dan ikatan ini dapat  dipisahkan dengan enzim histone deacetylase (HDAC). Target asetilasi adalah histon dan transcription factor seperti AR. Proses asetilasi ini akan meningkatkan aktivasi transkripsi dari beberapa gen spesifik. Gangguan keseimbangan antara HAT dan HDAC akan mengakibatkan penurunan fungsi beberapa gen pada penyakit-penyakit tertentu seperti Huntington Disease.

Secara normal, asetiasi AR terjadi di posisi 631-634 pada sekuens KXKK, dimana K adalah lysine dan X adalah asam amino apapun. Kegagalan fungsi/ mutasi yang terjadi pada posisi ini, akan mengakibatkan peningkatan agregasi polyQ yang efek sampingnya terjadi penumpukan material neurotoksik (10).

2.3  Ubiquitylation

Pengikatan ubiquitin dengan protein terjadi melalui ikatan isopeptida yang terbentuk antara lysine dari protein target, dan carboxy-terminal group dari ubiquitin. Ubquitilasi terjadi melalu beberapa tahapan yang melibatkan tiga jenis enzim, antaralain ubiquitin-activating enzyme (E1), ubiquitin-conjugating enzyme (E2) dan  ubiquitin-protein ligase (E3). Protein bisa mengalami proses mono- atau poly-ubiquitilasi. Mono-ubiquitinilasi meregulasi transkripsi gen, sedangkan poly- ubiquitinilasi menjadi sinyal degradasi protein, melalui proteasome.

Ubiquitinilasi memiliki peran yang sangat penting dalam patogensis polyQ disease. Ubiquitinilasi awalnya mencegah toksisitas polyQ dengan meningkatkan degradasi protein melalui proses poly-ubiquitilasi. Mutasi, atau kesalahan kerja yang terjadi saat proses ubiquitinilasi akan meningkatkan residu dari polyQ sehingga tercipta substrat yang bersifat neurotoksik (11).

2.4  Sumoylation

SUMOylation adalah penambahan SUMO (small ubiquitin-related modifier), pada protein di sisi lysine. Motif sekuens dari SUMOylation adalah CKX [ D/E ], dimana C adalah hydrophobic residue, K adalah acceptor lysine, X adalah asam amino apapun, dan D /E adalah aspartate atau glutamate. Proses sumoylation memiliki hubungan dengan kejadian hintington disease .Target utama dari sumoylation adalah protein polyQ htt, AR,dan ataxin 1. Kehilangan SUMO pada polyQ akan megurangi neurodegenerasi, namun peningkatan sumoylation akan meningkatkan stabilisasi dari polyQ htt, disini kemungkinan yang terjadi adalah adanya kompetisi dengan ubiquitinilasi pada residu lysine yang sama dan mengurangi agregasi dari polyQ htt (12)

2.5  Palmitoylation

Palmitoilasi adalah penambahan ikatan kovalen\nreversible dari rantai saturated palmitic fatty acid, dengan residu cysteine dari protein. Htt dan AR mengalami proses palmitoilasi. Palmitoilasi dibutuhkan untuk mengatur lalu-lintas protein sepanjang neuritis dan pembentukan formasi sinaps. Palmitoilasi dari polyQ AR dibutuhkan untuk lokalisasi menuju membrane plasma. Pada polyQ disease ditemukan adanya defek pada transport antero retrograde, sehingga terjadi rangsangan neurodegenerasi. Kehilangan proses Palmitoilasi akan memicu terjadinya peningkatan toksisitas seiring dengan peningkatan jumlah agregasi polyQ, dan akhirnya terjadi kematian sel, namun untuk proses spesifik palmitoilasi apakah benar-benar mempengaruhi toksisitas, masih belum diketahui (13)..

2.6  Transglutamination

Transglutaminase adalah bagian dari enzim yang teraktivasi kalsium yang mengkatalisasi reaksi transfer acyl antara glutamine dari salah satu protein, dan lysine pada protein lainnya agar terbentukikatan iso-peptida yang mengikat kedua protein. Sampai saat ini diketahui ada Sembilan jenis transglutaminase yang ada pada tubuh mamalia, dimana Transglutaminase type 2 adalah yang paling dominan di sel-sel otak. PolyQ ataxin 1 , AR dan htt adalah substrat untuk proses transglutaminase.

Gangguan pada transglutaminase akan berkontribusi terhadap pathogenesis polyQ disease. Mekanisme yang terjadi dapat dilihat dari eksperimen yang dilakukan sebelumnya, dimana mencit yang di hilangkan gen penyandi transglutaminase type 2,akan megalami manifestasi penyakit kerusakan sel-sel neuron. Itu berarti ada hubungan antara transglutaminase dengan pathogenesis polyQ disease (14)

2.7  Proteolytic Cleavage

Proses proteolysis, atau pemecahan protein polyglutamine yang terjadi berlebihan akan dapat memicu terbentuknya banyak fragmen toksik yang sebenarnya memiliki potensi neurotoksisitas yang besar. Dan telah banyak dibuktikan bahwa potensi fragmen protein ini lebih besar toksisitasnya dibandingkan protein polyglutamine yang utuh. Pemecahan/ pemotongan protein ini diperankan oleh caspase dan calpain. Caspase yang berperan antaralain capase 2, 3, 6 dan 7 bekerja pada lokasi  antara asam amino 513 and 586 . Calpains yang berperan adalah calpain 1 dan 2 memotong pada lokasi antara  aram amino 469 and 536 .Caspase dan calpain memotong protein terutama dari polyQ htt. Poly Q atropine 1 juga dipotong oleh caspase, namun pada lokasi aspartate 109 (15)..

3.      Agen penghambat post translational modification pada polyQ protein

Telah dibahas diatas, bahwa proses post translational modification dari protein polyQ mengalami gangguan, sehingga yang seharusnya tidak bersifat neurotoksik, akan menjadi kebalikannya. Proses ini terjadi karena mutasi dari gen-gen penyandi polyQ seperti gen polyQ htt, AR, atropine, ataxine , dan sebagainya yang sudah dijelaskan pada tabel 1 (16).

Untuk mengatasi mutasi yang telah terjadi, telah dilakukan berbagai penelitian untuk menemukan agen terapi yang tepat. Salah satu kandidat agen terapi untuk polyQ disorder adalah peptida QBP1 .Peptida QBP1bekerja dengan cara menghambat pemanjangan dari polyQ, sehingga tidak terjadi replikasi protein yang berlebihan, dan nantinya akan menurunkan sifat toksisitasnya. Peptide QBP1 bekerja hanya pada polyQ yang mengalami pengulangan berlebihan pada CAG, dan tidak mengganggu polyQ yang normal. Kinerja dari peptide QBP1adalah hambatan yang dilakukan terhadap protein  thio-Q62. Thio-Q62 ini memiliki peran dalam pembentukan β sheet monomer pada polyQ, sehingga memicu terbentuknya inclusion boddies (gambar 3) (16)

Gambar 3 menunjukkan QBP1 menghambat ekspansi dari protein polyQ yang berlebihan dan mencegah pembentukan β sheet monomer dan semua jalur setelahnya

Ada banyak subripe dari protein QBP1, namun, dari penelitian yang dilakukan, ikatan yang dilakukan oleh QBP1 terhadap Thio-Q62 lebih tinggi daripada subtype lain, sehingga diharapkan efektifitasnya dalam menghambat over ekspresi dari polyQ akan lebih baik. Jalur Thio-Q62 memang masih belum diketahui mekanismenya secara spesifik, namun diketahui bahwa Thio-Q62 berperan pada prose kesalahan genetika berupa misfolding sehingga jumlah protein polyQ menjadi berlebihan.

Tabel 2. Perbandingan ikatan subtype QBP terhadap Q62

Daftar Pustaka

  1. S. Nag afuchi, H. Yanag i sawa, K . S ato e t al., “Dentatorubral and pallido luysian at rophy expansion of an unstable C AG trinucleotide on chromosome 12p,” Nature Genetics , vol. 6, no.1, pp. 14–18, 1994
2.      P. W. Faber, J. R. Alter, M. E. Ma cdonald, and A . C . Har t, “Polyg lutamine-mediate d dysfunction and apoptotic death of a Caenorhabditis elegans sensory neuron,” Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America , vol. 96, no. 1, pp. 179–184, 1999.
3.      J. Wi lliams and H . L . Paulson, “Po lyg lutamine neurodegen-er ation: protein misfolding re v i site d,” Trends in Neurosciences , vol. 31, no. 10, pp. 521–528, 2008.
4.      Wellington, C.L., Ellerby, L.M., Hackam, A.S., Margolis, R.L., Trifiro, M.A., Singaraja, R., McCutcheon, K., Salvesen, G.S., Propp, S.S., Bromm, M. et al. (1998) Caspase cleavage of gene products associated with triplet expansion disorders generates truncated fragments containing the polyglutamine tract. J. Biol. Chem., 273, 9158 – 9167
5.      Colin, E., Regulier, E., Perrin, V., Durr, A., Brice, A., Aebischer, P., Deglon, N., Humbert, S. and Saudou, F. (2005) Akt is altered in an animal model of Huntington’s disease and in patients. Eur. J. Neurosci., 21, 1478 – 1488.
6.      Anne, S.L., Saudou, F. and Humbert, S. (2007) Phosphorylation of huntingtin by cyclin-dependent kinase 5 is induced by DNA damage andregulates wild-type and mutant huntingtin toxicity in neurons. J. Neurosci., 27, 7318 – 7328.
7.      Luo, S., Vacher, C., Davies, J.E. and Rubinsztein, D.C. (2005) Cdk5 phosphorylation of huntingtin reduces its cleavage by caspases: implications for mutant huntingtin toxicity. J. Cell Biol., 169, 647 – 656. 35. Kaminosono, S., Saito, T., Oyama, F., Ohshima, T., Asada, A., Nagai, Y.,
8.      Palazzolo, I., Burnett, B.G., Young, J.E., Brenne, P.L., La Spada, A.R., Fischbeck, K.H., Howell, B.W. and Pennuto, M. (2007) Akt blocks ligand binding and protects against expanded polyglutamine androgen receptor toxicity. Hum. Mol. Genet., 16, 1593 – 1603.
9.      Mahajan, N.P., Liu, Y., Majumder, S., Warren, M.R., Parker, C.E., Mohler, J.L., Earp, H.S. and Whang, Y.E. (2007) Activated Cdc42-associated kinase Ack1 promotes prostate cancer progression via androgen receptor tyrosine phosphorylation. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 104, 8438 – 8443.
10.  Thomas, M., Dadgar, N., Aphale, A., Harrell, J.M., Kunkel, R., Pratt, W.B. and Lieberman, A.P. (2004) Androgen receptor acetylation site mutations cause trafficking defects, misfolding, and aggregation similar to expanded glutamine tracts. J. Biol. Chem., 279, 8389 – 8395.
11.  DiFiglia, M., Sapp, E., Chase, K.O., Davies, S.W., Bates, G.P., Vonsattel, J.P. and Aronin, N. (1997) Aggregation of huntingtin in neuronal intranuclear inclusions and dystrophic neurites in brain. Science, 277, 1990 – 1993.
12.  Steffan, J.S., Agrawal, N., Pallos, J., Rockabrand, E., Trotman, L.C., Slepko, N., Illes, K., Lukacsovich, T., Zhu, Y.Z., Cattaneo, E. et al. (2004) SUMO modification of Huntingtin and Huntington’s disease pathology. Science, 304, 100 – 104.
13.  Pedram, A., Razandi, M., Sainson, R.C., Kim, J.K., Hughes, C.C. and Levin, E.R. (2007) A conserved mechanism for steroid receptor translocation to the plasma membrane. J. Biol. Chem., 282, 22278 – 22288.
14.  Ruan, Q., Quintanilla, R.A. and Johnson, G.V. (2007) Type 2 transglutaminase differentially modulates striatal cell death in the presence of wild type or mutant huntingtin. J. Neurochem. , 102, 25 – 36.
15.  Gafni, J. and Ellerby, L.M. (2002) Calpain activation in Huntington’s disease. J. Neurosci., 22, 4842 – 4849.
16.  H.Akiko Popiel, James R . Burke , Warren J. Stritt matter, Shinya Oishi, Nobutaka Fujii, Toshihide Takeu chi, Tatsushi Toda, Keiji Wada, and Yoshitaka Nagai The Aggregation Inhibitor Peptide QBP1 as a Therapeutic Molecule for the Polyglutamine Neuro degenerative Diseases. Journal of Amino Acids Volume 2011, Ar ticle I D 265084, 10 pages doi:10.4061/2011/265084